京都大学 ウイルス・再生医科学研究所 分子遺伝分野

研究内容


目的
ウイルス感染症は現代でも重要な疾患であり、大きな社会問題となっている。 ヒトを含む高等動物はインターフェロンによるウイルスに対する防御システムを有している。本研究室ではT型インターフェロン(Type I interferon、以下インターフェロン)に よる自然免疫機構に関する研究を行っている。ウイルスが感染すると我々の体にはウイルス由来のRNAが出現し、 それをRIG-Iというセンサー分子が感知してインターフェロン産生のシグナルが開始される。我々はRIG-Iによる防御機構の研究を中心に一連の自然免疫機構を明らかにし、 ウイルス感染や癌の治療に応用することを目的としている。
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[Index]
インターフェロン遺伝子の活性化機構とRIG-Iファミリー
RIG-Iの認識機構
IFNシグナル伝達と抗ウイルス応答
抗ウイルスストレス顆粒(avSG)とウイルスの攻防
植物由来の二重鎖RNAを用いた抗ウイルス効果
ミトコンドリアと自然免疫
IFNと自己免疫疾患
B型肝炎ウイルス(HBV)に関する研究



・インターフェロン遺伝子の活性化機構とRIG-Iファミリー
インターフェロン(IFN)遺伝子はウイルスをはじめとする病原体の感染によって活性化誘導される。 ほとんどの組織の細胞はウイルスが感染するとIFNを産生するが、この場合,細胞質に存在す るウイルスセンサータンパク質RIG-Iが感染を感知してIRF (Interferon Regulatory Factor)-3、 IRF-7といった転写因子が活性化され、それが標的遺伝子であるインターフェロン遺伝子の活性化を行う(下図参照)。 細胞の種類によっては細胞膜上に存在するTLR (Toll-Like Receptor) 3がウイルス感染細胞から由来する二重鎖RNAを感知してIRF-3、IRF-7の活性化を引き起こして同様な機構でIFN遺伝子の活性化 を行うことも報告されている。RIG-Iのほかにアミノ酸配列の類似性が高いMDA5およびLGP2という分子も IFN遺伝子の活性化に関わっていることがわかっており、この3種のタンパク質を総じて RIG-I-Like Receptor (RLR)と呼んでいる(下図参照)。MDA5もRIG-Iと同様に、ウイルス感染を認識するセンサー タンパク質として機能している。しかしながら、RIG-IとMDA5は異なる種類のウイルスを認識することが ノックアウトマウスの実験により明らかとなり(下図参照)、RNA構造の違いがこのような結果になっていると考えられる。 LGP2はRIG-I/MDA5のN末を削った構造をしており、RIG-I/MDA5と協調して働くことが予想されている。











・RIG-Iの認識機構
RIG-IはN末からcapase recruitment domain (CARD)、DExD/H box型のRNAヘリカーゼドメイン、 及びC-terminal domain (CTD)の3つの構造から成る(上図参照)。通常RIG-IはCARDを内側に包み込んだ不活性化状態でいるが、 ウイルス由来のRNAと結合することでその構造が変化し、CARDを露出した活性化状態になると考えられる。 これにより露出したCARDが下流のシグナル分子であるIPS-1と結合し、最終的にIFN遺伝子を活性化する。
RIG-Iのノックアウトマウスの研究からRIG-Iは特定のウイルスRNAを認識することが分かった。 また別の研究により、RIG-Iは5'末端にリン酸基を3つもったRNA (5'-pppRNA)を認識することが明らかとなった。 RNAの認識にはRNAヘリカーゼドメインとCTDが重要であり、我々はこのCTDの構造を 解析した。その結果CTDにはRNAと結合するのに重要な溝があり、この溝にRNAがはまることによりRIG-Iが活性化 するということが明らかとなった(下図参照)。RIG-Iの活性化状態への構造変化にはRNAヘリカーゼのATPase活性が必要であり、 ATPの加水分解によるエネルギーを利用して構造が変化すると考えられている。




・IFNシグナル伝達と抗ウイルス応答
ウイルスに感染した宿主細胞では、IFN産生を促進する因子やIFNによって発現誘導される因子など、様々な制御因子がウイルスに対抗するための応答を示す。植物から哺乳動物まで広く保存されているPumilioタンパク質は、LGP2と結合することでLGP2のRNA結合能を上昇させ、ウイルス感染時には、抗ウイルスストレス顆粒に局在し、IFN発現誘導を促進することで抗ウイルス応答を示すことが分かった (Narita, R., et al.,PLoS Pathog,2014,下図参照, 詳しくはこちら)。また、IFNが発現することによって誘導されるノンコーディングRNAのmiR23bが、特定のウイルス感染に対して、ウイルス受容体の量を減少させることによってウイルスの侵入を防ぐ機能をもつことが明らかとなった (Ouda, R., et al.,J Biol Chem, 2011,下図参照, 詳しくはこちら)。現在も、ウイルスと宿主の攻防の機構を明らかにするために、様々なウイルスを用いながら、IFNシグナル伝達経路に関与する新規因子の探索、解析を進めている。








・抗ウイルスストレス顆粒(avSG)とウイルスの攻防
ある特定のウイルスに感染すると、RLRsやProtein kinase R (PKR)などの抗ウイルス因子が局在する凝集体が形成される。この凝集体には、ウイルスの核酸やタンパク質が局在するため、ウイルス感知の場として機能していることが示唆される。また、この凝集体には、ストレス顆粒に見られる因子が複数見られることから、我々は抗ウイルスストレス顆粒(avSG: antiviral Stress Granule)と命名した。インフルエンザウイルスに感染するとavSGが形成されるが、ウイルス側の非構造タンパク質NS1が、PKRを介したavSGの形成を阻害することが明らかとなった(Onomoto, K., et al.,  PLoS One,2012,下図参照, 詳しくはこちら)。PKRは、avSG形成に必須の因子であり、RIG-Iと同じDExD/H-box RNA helicaseであるDHX36が、二重鎖RNA依存的にPKRを活性化し、avSGの形成とTRIM25のリクルートメントによってIFN誘導シグナルを伝達することも分かった (Yoo, J. S., et al,PLoSPathog,2014,下図参照, 詳しくはこちら)。







また、ピコルナウイルス科の脳心筋炎ウイルス (EMCV)の感染によってもavSGが形成されるが、EMCV側はウイルスタンパク質の3Cが、avSG形成に重要なG3BP1を分解することによって宿主側の抗ウイルス応答に対抗する(Ng, C. S., et al.,J Virol,2013,下図参照, 詳しくはこちら)。ニューカッスル病ウイルス (NDV)は、感染初期にグラニュール様に観察されるウイルスの複製複合体 (vRC)を宿主細胞に形成する。RIG-IはこのvRCに局在しており、ここでウイルスのRNAを感知しているものと思われる。感染後期にはavSGが形成され、ウイルスの(+)鎖RNAやRIG-Iが局在していることが分かった。さらに、ウイルスの(+)鎖の中に、Le-N(+) RT RNAというRIG-Iのリガンドとなり得るRNAが含まれていることが分かった。NDV感染では、avSGが形成される前にIFNの発現が見られていることから、avSGでは2次的な抗ウイルス応答が起きて、vRCでの抗ウイルス反応を補強していることが予想された (Oh, S. W., et al.,PLoS Pathog,2016,下図参照, 詳しくはこちら)。






・植物由来の二重鎖RNAを用いた抗ウイルス効果
イネなどの植物の中には、10 kbp以上の長い二重鎖RNAをゲノムとして有するEndornavirusが垂直伝播している種がある。近年、我々は米ぬかから二重鎖RNAを単離・精製することに成功し、その精製した米ぬか由来二重鎖RNA (rb-dsRNA) が、in vitro, in vivoいずれにおいても自然免疫を賦活化できることを明らかにした。マウスにrb-dsRNAを感染前後に投与すると、インフルエンザウイルス感染およびセンダイウイルス感染に対する抗ウイルス活性が見られた。この抗ウイルス活性はI型IFNシグナリング、および、I型IFNシグナリング非依存的なcaspase-1依存的シグナリングといった2つの独立したシグナル伝達系が重要な役割を担うことが判明した(Kasumba, D. M.,J Immunol,2017,下図参照, 詳しくはこちら)。
食用植物から単離・精製したdsRNAは毒性の心配が少ないため、ウイルス感染の予防や治療のために貢献できる可能性を持っており、さらなる理解のための研究を現在も積極的に進めている。





・ミトコンドリアと自然免疫
ミトコンドリアは、ATP産生によるエネルギー供給やアポトーシスを制御する細胞小器官としてよく知られているが、自然免疫反応において中心的役割を担うことが最近の研究で分かってきている。ウイルスRNAを感知したRLRsは、ミトコンドリア上のIPS-1にシグナルを伝達し、IFNを含むサイトカインの産生を誘導する。ウイルス感染や、5'-pppRNAのトランスフェクションによって、IPS-1が凝集すること、さらにミトコンドリア融合に必要なMfn1を欠損させるとIFN発現誘導が大きく抑えられたことから、ミトコンドリア上のIPS-1が凝集することが、RLRsを介したIFN発現誘導に重要であることが考えられた (Onoguchi., K., et al.,PLos Pathog,2010,下図参照, 詳しくはこちら)。また、IPS-1の多量体化を人工的に誘導できるシステムを構築することによって、オリゴマー化したIPS-1が下流へシグナルを伝達するために必要な領域は、CARDドメインとtransmembrane (TM)ドメインに挟まれた領域内のTumor necrosis factor Receptor-Associated Factor (TRAF) binding motifであることを明らかにした(Takamatsu, S., et al.,PLoS One,2013,下図参照, 詳しくはこちら)。ミトコンドリアが自然免疫系に関与する詳細な機構を明らかにするため、解析を続けている。







・IFNと自己免疫疾患
IFNは、ウイルスなどの外的因子から自己を守るためにその発現が誘導されるが、平常時は発現が抑えられている。しかしながら、何らかの要因によってIFN発現誘導のシグナル伝達系が制御不全となり、IFNが常時発現し続けることで自己免疫疾患を引き起こしてしまうことがある。
全身性エリテマトーデス (SLE)は、自己免疫疾患の1つであり、自分自身の核や二本鎖DNAに反応してしまうことによって、腎臓、皮膚、肺、脳や関節など全身の臓器に障害が生じる。20歳から40歳の女性に多く見られる疾患で、日本には2万人から4万人の患者がいると推定されている。
我々は、モデルマウスを用いて、MDA5のアミノ酸1つの置換変異が恒常的なMDA5の活性化を引き起こし、マウスにSLE様の症状が見られることを発見した (Funabiki, M., et al.,Immunity,2014,下図参照, 詳しくはこちら)。このSLEモデルマウスは、腎炎、自己抗体の生産、樹状細胞やマクロファージの恒常的活性化などの多様な表現型を示すが、MDA5下流のアダプターであるIPS-1もしくはIFNの受容体を欠損させることで表現型が抑えられたことから、IFNの恒常的産生によってSLE様疾患が生じていることが示された。現在はIFN産生が自己免疫疾患を引き起こす詳細な機構について理解するために様々な研究を進めている。





・B型肝炎ウイルス(HBV)に関する研究
B型肝炎は国際的なウイルス性肝炎であり、慢性肝炎になると肝硬変、肝がんに進行する。WHOの推計によると、B型慢性肝炎の患者は世界中で2.4億人にものぼり、毎年約70万人もの人々がHBV関連疾患で死亡している。B型慢性肝炎患者に対する治療法は未だに十分とは言えず、新たな抗ウイルス薬の開発が待たれている。しかしながら、HBVは実験的環境下における感染率が非常に低く、効率的な感染実験のモデルが確立されているとは言い難いのが現状である。
我々は、HBV受容体であるNTCPを安定発現させた肝臓細胞株をもとにしたIPS-1ノックダウン細胞を樹立し、HBVの感染性について解析を行った。そして、NTCPの発現効率、IPS-1のノックダウン効率が共に高い細胞クローンにおいて、感染性の向上および長期感染性の獲得を確認することができた(Yao, W. L. et al.,Int Immunol,2017,下図参照, 詳しくはこちら)。現在は、HBV長期感染性のメカニズム解明に加え、抗HBV薬の探索なども行っている。



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