中野雅博^1,2、杉田征彦^1,3,4、古寺哲幸⁵、宮本翔¹、村本裕紀子^1,2、Matthias Wolf⁴、野田岳志^1,2

1 京都大学 ウイルス・再生医科学研究所 微細構造ウイルス学分野
2 京都大学 大学院生命科学研究科 微細構造ウイルス学分野
3 京都大学 白眉センター
4 沖縄科学技術大学院大学 生体分子電子顕微鏡解析ユニット
5 金沢大学 ナノ生命科学研究所

Ultrastructure of influenza virus ribonucleoprotein complexes during viral RNA synthesis
Communications Biology. 4: 858 (2021)
doi: 10.1038/s42003-021-02388-4

インフルエンザウイルスのゲノムRNAは一本鎖のマイナス鎖RNAであり、核タンパク質NPやポリメラーゼとともにvRNPを形成する。vRNPは柔軟な二重らせん構造を持ちゲノムRNAの転写や複製を担うが、RNA合成中のvRNPの構造については十分には解明されていない。そこで本研究では、高速原子間力顕微鏡（AFM）およびクライオ電子顕微鏡（EM）を用いて、RNA合成中のvRNPの微細構造を解析した。

初めにウイルスから精製したvRNPを用いてin vitro RNA合成反応を行い、ウイルスRNAが合成されることを確認した。続いて、in vitro RNA合成中のvRNPを高速AFMおよびクライオEMで解析した。その結果、vRNPが二重らせん構造を維持したままRNAと結合している様子が認められた（下図①）。Br-UTPを用いた解析により、らせん状vRNPに結合したRNAはvRNPから新規合成されたRNAであることが確認された。一方で、二重らせん構造が崩壊したvRNPも認められ、このような不定形のvRNPは常にループ状RNAと結合していた（下図②）。Click反応とvRNPの構造安定性の力学的解析から、このループ状のRNAはvRNPから新規合成されたRNAとvRNPから外れたゲノムRNA（テンプレートRNA）から構成されることを明らかにした。

今回の結果から、vRNPは二重らせん構造を維持したままRNA合成を行うことで繰り返しのRNA合成（転写・複製）を可能にしていること、一方で、RNA合成中にvRNPからウイルスRNAが外れることでvRNPの二重らせん構造が崩れてしまい以降のRNA合成ができなくなる可能性が示唆された。本研究では高速AFMとクライオEMを組み合わせることにより、これまで分からなかったRNA合成中のvRNPの微細構造を明らかにすることに成功した。

 

図　RNA合成中のvRNPの高速AFM観察

① 二重らせんを維持したvRNPとRNA（矢印）のAFM像

② 二重らせんが崩れたvRNPとループ状RNA（矢印）のAFM像

スケールバー: 50 nm